Исследования в иммунологии

Вариабельность величины РОК может быть причиной плохо­го разделения клеточных популяций. Например, розетка, со­стоящая из малого лимфоцита и 18 эритроцитов (750 мкм), по объему мало отличается от розетки, образованной средним лим­фоцитом и 10 эритроцитами (720 мкм3). Обе оседают со скоро­стью 12 мм/ч (Elliott et al., 1975).

Эффективность разделения можно повысить, если перед ро- зеткообразованием в течение 3,5—4 ч провести седиментацию клеток; при этом можно выделить две популяции клеток, более гомогенных по размерам: малые (2,5—4 мм/ч) и средние (4— 5 мм/ч) лимфоциты. Каждую из этих популяций после розетко- образования подвергают дальнейшему разделению по описанной выше методике (Elliott, Haskill, 1973). Однако при интерпрета­ции получаемых результатов важно учитывать, что каждая из этих популяций РОК может оказаться неслучайной выборкой исходных нефракционированных клеток.

А. Тимомы мышей AKRМыши AKR исходно были выведены как инбредная линия с высокой частотой спонтанных лейкемий. Тимомы, возникающие у мышей AKR, обусловлены вертикальной (генетической) пере­дачей эндогенного опухолеродного вируса. Как показал Гросс (1951), тимомы могут также передаваться горизонтально путем инокуляции бесклеточного экстракта, полученного из опухолей мышей AKR новорожденным мышам СЗН, у которых частота спонтанных лейкемий исключительно низка. Приблизительно у 50% инокулированных мышей СЗН развивается лейкемия в воз­расте от 8 до 11 мес. Частота лейкемии у различных сублиний мышей AKR значительно варьирует (Acton et al., 1973) и может достигать 90% в возрасте 9 месяцев. Опухолевые клетки несут 0-антиген на своей поверхности. Клетки наиболее часто исполь­зуемой сублинии AKR/J несут антиген Thy 1.1 (традиционное на­именование — й-AKR), тогда как другие сублинии, как, напри­мер, AKR-Cum, имеют антиген Thy 1.2 (О-СЗН) (Acton et al., 1973).

После того как выяснены условия воспроизводимого прими­рования, можно приступать к получению фактора. Суспензию се­лезенки, содержащую обученные Т-клетки, готовят в минималь­ной среде Игла с глутамином без отмывания. Если же Т-клетки необходимо отмыть или разделить на найлоновой вате, то в среду добавляют сыворотку плода коровы (10%). Взвесь клеток (Т, G)-A-L доводят до концентрации 107/мл и добавляют анти­ген. Оптимальную концентрацию антигена необходимо подобрать экспериментальным путем; для (Т, G)-A–L она составляет 1 мкг/мл, для БЭ — 0,1 мл 0,1%-ной суспензии на 1 мл культу­ры. Чашки Петри, содержащие 2—3 мл суспензии, инкубируют 8 ч в атмосфере из 5% С02 и 95% воздуха при 37°С. Оптималь­ную продолжительность культивирования также подбирают эм­пирически. Жизнеспособность обученных Т-клеток рекомендуется оценивать в начале и в конце культивирования с помощью три- панового синего. За это время должно погибать не более 20— 30% клеток. Если жизнеспособность клеток удовлетворительная, то клетки удаляют центрифугированием и надосадочную жид­кость используют в качестве источника фактора Т-клеток.

Чтобы определить наличие фактора и степень его активности, смесь надосадочной жидкости и клеток костного мозга вводят облученной мыши-реципиенту (рис. 2, Б). Нет необходимости в том, чтобы Т-клетки — продуценты растворимого фактора — обя­зательно были сингенны костномозговым клеткам; установлено, что хелперный фактор одинаково хорошо функционирует как в сингенной, так и в аллогенной комбинации (Munro, Taussig, 1975; Taussig et al., 1974). Эффективность T — В-кооперации в изучаемой системе сначала необходимо проверить in vivo при переносе нормальных или «обученных» клеток тимуса вместе с костномозговыми клетками, ибо оценка фактора основана на его способности выполнять специфическую функцию вместо Т-клеток. Содержащую фактор надосадочную жидкость смешивают с кост­номозговыми клетками и антигеном и полученную взвесь вводят в хвостовую вену мышам-реципиентам после облучения их ле­тальной дозой. Количественное соотношение фактора и клеток подбирают так, чтобы каждый реципиент получил 7г селезеноч­ного эквивалента или же один эквивалент (один селезеночный эквивалент соответствует количеству фактора, образованного при культивировании клеток одной селезенки) и 2-Ю7 костно­мозговых клеток.

Предметное стекло следует покрыть тонким слоем 0,1—0,2%- ной агарозы и высушить. Образующаяся пленка способствует плотному прикреплению к стеклу слоя агарозы, содержащего клеточную суспензию. 0,5%-й раствор расплавленной агарозы в сбалансированном солевом растворе разливают по 0,5 мл в по­догретые пробирки, помещенные в водяную баню (45°С). При­бавляют по 50 мкл 15%-ной (по объему) суспензии БЭ и по 10—100 мкл взвеси лимфоидных клеток; смесь переносят на предметные стекла, покрытые пленкой агарозы, и равномерно распределяют по их поверхности, выравнивая слой боковой по­верхностью пробирки. Стекла оставляют на горизонтальной по­верхности, пока не застынет гель, затем их кладут слоем геля вниз в специальные лотки из люцита с небольшим углублением (21,5X4,7X0,1 см). Пространство между предметными стеклами н дном лотка заполняют комплементом морской свинки, разве­денным CP 1 : 10. Лотки ставят друг на друга и помещают в пластиковые коробки, на дно которых для создания влажной атмосферы кладут мокрую фильтровальную бумагу, и инкуби­руют 2—3 ч при 37°С. Для подсчета АОК стекла погружают в физиологический раствор, затем тыльную поверхность нх выти­рают насухо и просматривают препараты в ярком отраженном свете. Наилучшие результаты получаются в тех случаях, когда на одном стекле появляется от 40 до 100 зон гемолиза.

На следующий день стекла промывают 0,15 М раствором NaCl в течение 5—15 мин. Стекла обсушивают, чтобы убрать избыток физиологического раствора, внешние края агара обре­зают бритвой (см. пунктирные линии на рис. 2) и стекла поме­щают на подогреваемую поверхность. В стеклянных пробирках (0,5×8 см), находящихся в водяной бане при 45°С, готовят сле­дующую смесь: 0,25 мл 0,7%-ного раствора Бактоагара в МСИ, 20 мкл 1%-ного ДЭАЭ-декстрана и 20 мкл 20%-ной суспензии БЭ. Смесь выливают на предметные стекла сразу после приготов­ления.

Стекла переносят на охлаждаемую поверхность и оставляют на 1—2 мин, затем, перевернув, их вкладывают в специальные люцитовые лотки, углубление которых заполняют истощенным БЭ комплементом морской свинки, разведенным в МСИ 1 : 10. Расположение гемолитического пятна определяют после 2,5-часо­вой инкубации во влажной атмосфере ССЬ-термостата.

Округлое пятно лизиса вокруг средней лунки свидетельствует о том, что торможения реакции не произошло. Полукруглая зона- гемолиза означает, что антитела к БЭ были блокированы анти­аллотипической сывороткой, помещенной в лунку с той стороны, где лизис отсутствует; это свидетельствует о проявлении данного аллотипа (рис. 3).

Торможения может не быть потому, что антитела, находящие­ся в жидкости, не несут испытуемого аллотипа, или потому, что эти антитела представляют собой смесь двух популяций молекул: первая популяция молекул несет данный аллотип и, следователь­но, блокируется антисывороткой, а йторая — продукт проявления другого аллеля, антисывороткой не блокируется и дает полный лизис. Во втором случае смесь антител к двум аллельным алло- типам, помещенная в одну из крайних лунок, будет вызывать полное торможение гемолиза.

Чувствительность этого метода трудно точно оценить. Однако о его надежности при определении примесных антител, образо­ванных другими клонами, говорит тот факт, что при испытании пятнадцати произвольно составленных смесей антител двух ал- лельных аллотипов (Ь4 и Ь6) во всех случаях были выявлены оба аллеля.